La neoplasia linfoide difuso gran …

La neoplasia linfoide difuso gran ...

Abstracto

Introducción

métodos

selección de los pacientes

Anticuerpos monoclonicos

preparación de las células

El análisis FCM

análisis de fluorescencia cuantitativo se realizó usando un Beckman Coulter FC500 Cytomics equipado con una sola fuente de láser de argón de 488 nm. emisión de FITC / PE / PE-Cy5 se recogió en FL1 / 2/4 canales usando 525/575/675 filtros de paso de banda nm, respectivamente. la calibración del instrumento se realizó a diario Utilizando el montaje de flujo / flujo de Comprobación perlas (Beckman Coulter).

Análisis de los datos

La inmunohistoquímica

Determinación de los subtipos DLBCL

La secuenciación del exón 5 del gen MS4A1 (CD20)

Quince muestras que fueron considerados CD20 discordante (dim CD20 y CD19 brillante) tenían suficiente tejido congelado restante para permitir la extracción de ADN usando el kit de ALL PREP (QIAGEN). Que amplifica el exón 5 de MS4A1 con los siguientes cebadores de PCR: 5-TGTAAAACGACGGCCAGT TTGGAATTCCCTCCCAGATT-3 y 5-CAGGAAACAGCTATGAC GGATCCAGAGTTCATGCTCA-3; 21M13F y M13R se utilizaron como extensiones de etiqueta de secuencia (subrayado) para facilitar la secuenciación con cebadores M13 estandarizados. 13 El purificada 431 pb producto de la PCR fue secuenciado bidireccionalmente usando BigDye Terminator, versión 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un ABI 3730 XL secuenciador (Applied Biosystems). La secuencia de avance y retroceso dice estaban reunidos juntos y se analizó usando PolyPhred y visualiza usando Consed. 14, 15

análisis estadístico

análisis de supervivencia univariante se realizó mediante la prueba de log-rank y el método de Kaplan-Meier (software SPSS, versión 11). Se utilizó el modelo de riesgos proporcionales de Cox para determinar la relación entre la supervivencia y las covariables conocidas en este estudio. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para determinar la asociación entre la expresión de CD20 y la expresión de CD5. Bilateral PAG valores de 0,05 se consideró significativo.

resultados

la expresión de CD19 fue también muy heterogénea y mostró patrones de distribución similares a CD20 (Figura 1 B, C). Esto también es cierto para FMC7, un epítopo de CD20 (datos no mostrados). 16, 17 Curiosamente, una muestra mostró al menos 3 poblaciones de CD19 + células que presentan diferentes intensidades de FMC7, lo que sugiere que las poblaciones clonales con diferente expresión CD20 pueden existir dentro del mismo tumor (Figura S1, disponible en el Sangre sitio web; consulte el enlace de Materiales Complementarios en la parte superior del artículo en línea). Todas menos una muestra con la expresión de CD20 dim también tenía tenue expresión para FMC7. Sin embargo, el 12% de las muestras FMC7 tenues eran brillantes para CD20. En general, se definieron 4 grupos principales basándose en el patrón de su CD19 y la expresión de CD20 (Tabla 2). Estos grupos serán referidos al brillante como concordante, tenue concordante, CD19 discordantes (dim CD19 y CD20 brillante), y CD20 discordantes (dim CD20 y CD19 brillante).

La incidencia de muestras DLBCL estratificó según la expresión de CD19 y CD20

expresión CD20 reducida está asociada con una supervivencia inferior

Sobrevivencia promedio. (A, B) Los pacientes con DLBCL según la expresión CD20. (A) CHOP tratada. tratado (B) R-CHOP. (C, D) Los pacientes con DLBCL de acuerdo con la expresión de CD20 y CD19. (C) CHOP tratada. tratado (D) R-CHOP.

expresión CD20 discordante se asocia con la expresión de CD5 y Bcl-2 expresión

La supervivencia global de los pacientes con DLBCL según la expresión CD5. (A) CHOP tratada. tratado (B) R-CHOP.

Características clínicas y patológicas de los pacientes con biopsias DLBCL que tienen CD20 discordantes o expresión CD5

Discusión

Las mediciones cuantitativas de la intensidad de fluorescencia utilizando estándares de microperlas se considera el estándar de oro en la determinación de la cantidad de antígenos en las poblaciones de células específicas de interés. 30 Recientemente, 3 tales ensayos fueron probados en la LLC y que resultaron ser muy reproducibles en la evaluación de la expresión del antígeno CD20 cuantitativa. 31 No hicimos uso de tales métodos para evaluar la expresión del antígeno en nuestro estudio, posiblemente teniendo en cuenta algunas de las variables que nos encontramos. Sin embargo, nuestros datos FCM se acumularon en un solo instrumento con una configuración constante para toda la cohorte de muestras incluidas en este estudio y con sólo 2 alteraciones significativas en los valores de voltaje durante un periodo de 10 años. Todos los demás parámetros del instrumento se mantuvieron constantes durante toda la década, lo que permite el análisis de cientos de muestras en una plataforma instrumento consistente. Los resultados de este estudio proporcionan pruebas suficientes de que el uso de FCM con estándares de calibración adecuados se debe utilizar para estudiar más neoplasias de células B, incluyendo SLL / CLL, cada vez que los pacientes son candidatos para la inmunoterapia anti-CD20.

Expresiones de gratitud

Se agradece al Dr. Banerjee Diponkar por sus útiles discusiones, que nos llevó a investigar CD20 dim como una posible causa de la resistencia R-CHOP, así como el flujo clínico dedicado citometría de técnicos de laboratorio en la British Columbia Cancer Agency para el trabajo duro.

Notas al pie

La versión en línea de este artículo contiene un suplemento de datos.

Paternidad literaria

Contribución: N.A.J. diseñado y realizado la investigación, analizaron los datos, y escribió el manuscrito; MEGABYTE. A. B. R.R.B. S.L. y A.B.-W. contribuido al análisis de datos y revisó el manuscrito; M. C. contribuido a la revisión patológica; L.H.S. y J.M.C. contribuido recopilación de datos clínicos y ayudó con la edición y revisión del manuscrito; A.P.W. contribuido con el diseño de la investigación y ayudó con la edición y revisión del manuscrito; y R.D.G. contribuido con el diseño de la investigación, el análisis patológico de los tejidos, la edición y la revisión y revisión final del manuscrito.

Conflicto de intereses divulgación: R.D.G. L.H.S. y J.M.C. han recibido fondos de investigación de Roche Canadá. El resto de autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Correspondencia: Randy D. Gascoyne, Departamento de Patología, British Columbia Cancer Agency, 600 W 10th Ave, Vancouver, BC V5Z 4E6, Canadá; e-mail: ac.cb.recnaccb@nyocsagr.

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Se proporcionan artículos de sangre aquí por cortesía de Sociedad Americana de Hematología

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